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上海奧析科學儀器有限公司紫外分光光度計測
更新時間:2016-08-31 點擊次數(shù):2912

3 1 0 2唾液酸測定法

(間苯二酚顯色法)

本法系用酸水解方法將結(jié)合狀態(tài)的唾液酸變成游離狀

態(tài),游離狀態(tài)的唾液酸與間苯二酚反應生成有色化合物,再

用有機酸萃取后,測定唾液酸含量。

睡液釀對照品溶液(200pg/inl)的制備精密稱取唾液

酸對照品10.52mg(lMg 唾液酸相當于3. 24mnol),置10ml

量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,混勻,即為唾液酸貯備液

( lm g /m l) ,按一次使用量分裝,一7CTC貯存,有效期1 年。

僅可凍融1次。4°C保存使用期為2 周。精密量取唾液酸貯

備液l m l ,5m l量瓶中,加水至刻度,即為每lm l

200Mg 的唾液酸對照品溶液,用前配制。

用于C 群腦膜炎奈瑟球菌多糖疫苗唾液酸含量測定時,

同法制備濃度為400Mg /m l的唾液酸對照品溶液貯備液(精

密稱取唾液酸40mg,置100ml量瓶中,用純化水溶解并定

容至刻度,混勻,即得)。精密量取唾液酸貯備液2.0ml,

10ml量瓶、中,加水至刻度,即為每lm l含唾液酸80邶的

唾液酸對照& 溶液,用前配制。

測定法取供試品適量,加水稀釋至蛋白質(zhì)濃度為每

. 226 .

lm l0.2.0.4mg,作為供試品溶液。按下表取唾液酸對

照品溶液、水及供試品溶液于10ml玻璃試管中,混勻,每

管再加人間苯二酚-鹽酸溶液(分別量取2% 間苯二酚溶液

2.5ml0. lm o l/L 硫酸銅溶液 62. 5^1、25% 鹽酸溶液 20ml

加水稀釋至25ml,混勻。試驗前4 小時內(nèi)配制)lm l,加蓋,

沸水煮沸3 0分鐘(水浴面高于液面約2cm),取出置冰浴中3

分鐘(同時振搖)后,每管加乙酸丁酯-丁醇溶液(取4 體積乙

酸丁酯與1 體積丁醇混勻,室溫下保存,1 2小時內(nèi)使用)

2ml,充分混勻,室溫放置1 0分鐘,照紫外-可見分光光度

法(通則0401),在波長580nm處測定吸光度。

唾液酸含量(Mg)

供試品

空白2 4 5 6 8

唾液酸對照品溶液(1) 10 20 25 30 40

( Ml) 100 90 80 75 70 60

供試品溶液( Ml) 100

腦膜炎球菌疫苗唾液酸含量測定:取含唾液酸約4CVg/ml

的供試品溶液和純水對照各2ml, 另分別取唾液酸對照品

(80/^g/ml) 0. lm l、0.2ml、0_4ml0_ 8ml、1.6ml 于各管中,

補水至2,O m l為標準曲線各點。各管加2 m l顯色劑

(0. lm o l/L硫酸銅溶液0.5ml4%間苯二酚溶液5ml,濃鹽

80ml,補水至100ml混勻。臨用現(xiàn)配)搖勻,沸水浴15

分鐘后冰浴5.10分鐘,每管加4m l有機相(正丁醇15ml,

加乙酸丁酯定容至100ml),充分搖勻后置室溫10分鐘。以

純水對照為0 點,于585nm測定吸光度,并作直線回歸。

(可按比例縮小供試品及各試劑體積)

以唾液酸對照品溶液的濃度對其相應的吸光度作直線回

歸(相關(guān)系數(shù)應不低于0 .99),由直線回歸方程計算5Mg 唾液

酸的吸光度值,再按下式計算供試品唾液酸含量。

促紅素供試品唾液酸含量— A 2X 5X3. 2A XW X n

(mol/mol 蛋白質(zhì)) A7XPXTOO

式中烏為5Mg 唾液酸的吸光度;

A 2為供試品的吸光度;

. 為供試品稀釋倍數(shù);

P 為供試品蛋白質(zhì)含量,Mg /p l;

W lrn n o l促紅素的量(不包括糖成分量),相當

30. 6/xg0

腦膜炎奈瑟球菌多糖疫苗供試品唾液酸含量(/ x g /m l) =

A X nA 為供試品溶液吸光度相對于唾液酸對照品溶液的濃

度,fig /m li

n 為供試品的稀釋倍數(shù)。

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