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紫外可見分光光度計測蛋白質(zhì)分子
更新時間:2016-08-17 點擊次數(shù):2423

第二法福林酚法(1^ * 17>

本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與

C u 2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物,此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬

酸還原,產(chǎn)生藍色化合物,同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應(yīng)。在

一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比,以蛋白質(zhì)對

照品溶液作標準曲線,采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的

含童。

本法靈敏度高,測定范圍為20.25C^ g。但對本法產(chǎn)生

干擾的物質(zhì)較多,對雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生干擾的離子,同樣容易

干擾福林酚反應(yīng),且影響更大。如還原物質(zhì)、酚類、枸櫞

酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘

油等均有干擾作用。

除另有規(guī)定外,按方法1操作;如有干擾物質(zhì)時,除另

有規(guī)定外,按方法2操作并需經(jīng)方法學(xué)驗證。

方法1:

試劑堿性銅試液取氫氧化鈉I0 g,碳酸鈉50g,加

400ml使溶解,作為甲液;取酒石酸鉀0.5g,加水50ml

使溶解,另取硫酸銅0.25g,加水30ml使溶解,將兩液混

合作為乙液。臨用前,合并甲、乙液,并加水至500ml。

對照品溶液的制備除另有規(guī)定外,取血清白蛋白(牛)

對照品或蛋白質(zhì)含量測定國家標準品,加水溶解并制成每

lm l中含0. 2mg的溶液。

供試品溶液的制備照各品種項下規(guī)定的方法制備(蛋

白質(zhì)濃度應(yīng)與對照品溶液基本一致)。

測定法精密量取對照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、

0. 6mK 0.8ml、1. Oml(對照品溶液取用量可在本法測定范

圍內(nèi)進行適當(dāng)調(diào)整),分別置具塞試管中,各加水至l.Otnl,

再分別加入堿性銅試液1 .0 m l,搖勻,室溫放置1 0分鐘,

各加人福林酚試液[ 取福林試液中的貯備液(2m o l/L酸濃

度)116] 4 .0 m l,立即混勻,室溫放置3 0分鐘,照紫外-

可見分光光度法(通則0401),在650mn的波長處測定吸光

度;同時以0 號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應(yīng)

的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量,

同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃

度,并乘以稀釋倍數(shù),即得。

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